ＤＮＡ増幅の原理はＰＣＲ法と同じですが、サーマルサイクラーと蛍光検出器が組み合わされた装置を使用します。目的遺伝子に設定したプライマーとプローブを用いてＤＮＡの増幅を行い、その蛍光強度をモニタリングすることで遺伝子の定量を行う検査方法です。リアルタイムＰＣＲの代表的な方法には、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉなどのインターカレーターを用いる方法やＴａｑＭａｎプローブなどの蛍光標識プローブを用いる方法がありますが、今回は弊社でEBウイルス核酸定量法に用いているＴａｑＭａｎプローブ法について説明します。

　ＴａｑＭａｎプローブとは、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドです（図2）。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリング反応で鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズします。
プローブ上にクエンチャー物質が存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されています。その後の伸長反応ステップで、ＴａｑＤＮＡ　ポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光を発します。核酸の定量は、PCR増幅産物すなわち蛍光強度が一定量に達した時のサイクル数とDNA初期量に直線性が得られることを利用して、段階希釈した既知量のDNA（検量線）から検体のDNA量を算出します（図3）。

図3.リアルタム.PCR法の原理

図5. EBウイルスクロナリティの検査工程と解析像

　スライドグラス上で、細胞や染色体のＤＮＡ、あるいはｒＲＮＡと標識プローブをハイブリダイゼーションさせ顕微鏡下でウイルス感染細胞の確認や目的遺伝子（濃褐色に染色されているのがEBER）の局在性を証明する検査方法です（図6）。

　以上、基礎編ではEBウイルスに用いる核酸検査の測定方法と原理について説明しました。次回のＰａｒｔ２では、弊社で実施しているＥＢウイルス核酸検査の特徴や意義について紹介します。

ＥＢウイルスはＤＮＡウイルスですが、ＲＮＡウイルスの場合、ＰＣＲはどのように検査するのでしょうか？

 ＲＮＡウイルスを対象としたＰＣＲ法にＲＴ－ＰＣＲ法（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）があります。ＲＮＡは一本鎖なので、そのままではＰＣＲを行えません。そのため、逆転写酵素を用いてＲＮＡを鋳型としてDNAへの逆転写反応を行い、ｃＤＮＡ　（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ）を合成します。このｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行う検査法です。

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